Questão de Biomedicina - Análises Clínicas — Biologia Molecular em Biomedicina — CESPE / CEBRASPE 2025

Sequenciamento de Sanger: terminação de cadeia por ddNTPs

✅ CERTO. O método de Sanger, também chamado de sequenciamento por terminação de cadeia, baseia-se exatamente no uso de nucleotídeos modificados — os didesoxinucleotídeos (ddNTPs) — que, ao serem incorporados à fita de DNA em crescimento, interrompem a replicação naquela posição. Como a incorporação ocorre de forma aleatória ao longo da sequência, geram-se fragmentos de todos os tamanhos possíveis, cada um terminando em uma base específica. Essa é a essência da técnica descrita por Frederick Sanger em 1977.

O sequenciamento de Sanger é um marco da biologia molecular e foi a primeira técnica de sequenciamento de DNA desenvolvida. Para entender por que a afirmação está correta, é preciso compreender o mecanismo molecular por trás da técnica. A DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA adicionando nucleotídeos à extremidade 3' da fita em crescimento. Para que essa adição ocorra, o nucleotídeo a ser incorporado precisa ter um grupo hidroxila (OH) livre no carbono 3' da pentose, pois é ali que se forma a ligação fosfodiéster com o fosfato do próximo nucleotídeo.

Os ddNTPs são análogos dos desoxinucleotídeos normais (dNTPs), mas diferem por não possuírem o grupo OH no carbono 3'. Essa ausência é a chave da técnica: quando um ddNTP é incorporado pela DNA polimerase, a cadeia não pode mais ser estendida, pois não há o grupo 3'-OH para formar a próxima ligação fosfodiéster. A replicação é, portanto, terminada naquele ponto.

Na prática, a reação de sequenciamento contém o DNA molde, um primer, a DNA polimerase, os quatro dNTPs e uma pequena proporção de ddNTPs (cada um marcado com um fluoróforo diferente). Como os ddNTPs estão em menor concentração, a incorporação deles é um evento aleatório: na maioria das vezes, a polimerase adiciona um dNTP e continua a síntese; ocasionalmente, incorpora um ddNTP e a cadeia é interrompida. Ao final da reação, tem-se uma mistura de fragmentos de todos os comprimentos possíveis, cada um terminando em uma base específica (A, T, C ou G). A separação desses fragmentos por eletroforese capilar ou em gel de poliacrilamida revela a sequência de bases do DNA.

É importante distinguir o método de Sanger (primeira geração) das gerações seguintes de sequenciamento. Enquanto o Sanger depende da terminação de cadeia por ddNTPs, os métodos de segunda geração (como Illumina e Ion Torrent) detectam a incorporação de nucleotídeos em tempo real, seja por fluorescência ou por variação de pH. Já os métodos de terceira geração (PacBio e Nanopore) sequenciam moléculas únicas de DNA, sem necessidade de amplificação prévia. A pegadinha que a banca poderia explorar seria atribuir ao Sanger características das gerações posteriores, como o sequenciamento de molécula única ou a detecção em tempo real — mas a afirmação do enunciado descreve corretamente o mecanismo de terminação de cadeia.

Guarde o critério decisivo: a interrupção da replicação ocorre porque o ddNTP não possui o grupo 3'-OH, essencial para a formação da ligação fosfodiéster. É exatamente esse detalhe molecular que torna a afirmação correta.

Alternativa C — ✅ Certo ⟵ GABARITO

A afirmação está correta porque descreve com precisão o mecanismo do método de Sanger. Os nucleotídeos modificados (ddNTPs) interrompem a replicação do DNA em pontos aleatórios sempre que incorporados à fita replicante. A aleatoriedade decorre da proporção entre dNTPs e ddNTPs na reação: como os ddNTPs estão em menor quantidade, a incorporação deles é um evento probabilístico, gerando fragmentos de todos os tamanhos possíveis. A interrupção ocorre porque o ddNTP não possui o grupo 3'-OH, impedindo a formação da ligação fosfodiéster com o próximo nucleotídeo. Esse é o princípio fundamental da técnica de terminação de cadeia descrita por Sanger em 1977.

Gabarito: letra C (CERTO).