Questão de Biomedicina - Análises Clínicas — Biologia Molecular em Biomedicina — CESPE / CEBRASPE 2025

Sequenciamento de DNA: gerações e etapas

Gabarito: ERRADO. A afirmativa está incorreta porque a biblioteca de DNA não é a última etapa dos sequenciamentos de segunda geração — ela é uma etapa preparatória, que ocorre antes do sequenciamento propriamente dito. A construção da biblioteca envolve a fragmentação (clivagem) do DNA e a ligação de adaptadores, mas a etapa final é o sequenciamento em si, com a detecção das bases. A banca inverteu a ordem das etapas, uma pegadinha clássica.

O sequenciamento de DNA é o conjunto de técnicas que determina a ordem das bases nitrogenadas (A, C, G, T) em uma molécula de DNA. A primeira geração, o método de Sanger (1977), baseia-se na incorporação de dideoxinucleotídeos (ddNTPs) que terminam a síntese da fita, gerando fragmentos de tamanhos distintos que são separados por eletroforese. Já os sequenciamentos de segunda geração (NGS — Next-Generation Sequencing), como Illumina, Ion Torrent e 454 Roche, caracterizam-se pelo processamento paralelo massivo de milhões de fragmentos de DNA simultaneamente. A terceira geração (PacBio, Nanopore) sequencia moléculas únicas em tempo real, sem necessidade de amplificação.

Nos métodos de segunda geração, o fluxo de trabalho segue uma sequência lógica: primeiro, o DNA é fragmentado e preparado — é a etapa de construção da biblioteca; depois, os fragmentos são amplificados (formação de clusters, no caso da Illumina); e, por fim, ocorre o sequenciamento, com a leitura das bases e a geração dos dados. A biblioteca é, portanto, o ponto de partida, não o ponto de chegada. O material de apoio confirma essa estrutura ao descrever, para a plataforma Illumina, que a técnica é dividida em três etapas: preparação da amostra (que inclui a ligação de adaptadores), formação de clusters e sequenciamento. A etapa final é o sequenciamento, com a leitura das imagens capturadas em cada ciclo.

A pegadinha da questão está em afirmar que a biblioteca é a "última etapa" e que envolve "clivagem e marcação". A clivagem (fragmentação) e a marcação (ligação de adaptadores) são, de fato, parte da construção da biblioteca, mas essa etapa é inicial, não final. O candidato que conhece o fluxo do NGS percebe imediatamente a inversão. Além disso, a "marcação" mencionada pode confundir com a marcação fluorescente dos nucleotídeos, que ocorre durante o sequenciamento, mas a biblioteca em si é preparada antes.

Guarde a sequência: fragmentação → ligação de adaptadores (biblioteca) → amplificação → sequenciamento → análise de dados. É exatamente essa ordem que a questão tenta inverter.

Item — ❌ ERRADO

A afirmativa está errada por dois motivos: (1) a biblioteca de DNA é uma etapa preparatória e não a última; (2) a etapa final dos sequenciamentos de segunda geração é o sequenciamento propriamente dito, com a detecção das bases incorporadas. A construção da biblioteca envolve a clivagem do DNA em fragmentos e a ligação de adaptadores, mas isso ocorre antes da amplificação e do sequenciamento. O material de apoio descreve, para a plataforma Illumina, que a técnica é dividida em três etapas: preparação da amostra (biblioteca), formação de clusters e sequenciamento — sendo esta última a etapa final. Portanto, a afirmação inverte a ordem correta das etapas.

Gabarito: ERRADO.