Questão de Biomedicina - Análises Clínicas — Biologia Molecular em Biomedicina — CESPE / CEBRASPE 2025

Prevenção da degradação de RNA em amostras biológicas

Gabarito: ERRADO (letra E). A afirmativa está incorreta porque aquecer RNA a 95 °C por 15 minutos na presença de MgOH₂ e CaCl₂ não previne sua degradação; ao contrário, o calor intenso e a presença de íons divalentes (Mg²⁺, Ca²⁺) favorecem a hidrólise e a ação de RNAses, degradando o RNA. A prevenção adequada envolve o uso de inibidores de RNAses, soluções estabilizadoras (como isotiocianato de guanidina), armazenamento a baixas temperaturas (nitrogênio líquido ou -70 °C) e manipulação em ambiente livre de RNAses.

O RNA é uma molécula intrinsecamente instável, muito mais suscetível à degradação do que o DNA. Isso ocorre porque a ribose (açúcar do RNA) possui um grupo hidroxila (-OH) no carbono 2', que participa de reações de hidrólise, especialmente na presença de íons metálicos divalentes (como Mg²⁺ e Ca²⁺) e em temperaturas elevadas. Esses íons atuam como catalisadores da clivagem do esqueleto fosfodiéster, e o calor fornece a energia de ativação necessária. Portanto, a combinação descrita na afirmativa — aquecimento a 95 °C com MgOH₂ e CaCl₂ — é exatamente o oposto do que se deseja: ela acelera a degradação do RNA, em vez de preveni-la.

Na prática laboratorial, a preservação da integridade do RNA é crítica para análises de expressão gênica, como a PCR em tempo real (qPCR) e o sequenciamento de RNA. As principais estratégias para evitar a degradação incluem:

• Inibição de RNAses: enzimas que degradam RNA são ubíquas (presentes em mãos, superfícies e até no ar). Utilizam-se inibidores de RNAses, como o DEPC (dietilpirocarbonato) para tratar água e soluções, e soluções caotrópicas como isotiocianato de guanidina, que desnaturam as RNAses.

• Baixas temperaturas: o RNA deve ser mantido em gelo durante o processamento e armazenado a -70 °C ou em nitrogênio líquido. O congelamento rápido em nitrogênio líquido é recomendado para tecidos, como mencionado no contexto: "Para extração de RNA, a amostra deve ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido antes de ser congelada a -70 °C ou inferior, ou colocada em solução estabilizadora de RNA ou processada para extração de RNA em no máximo uma hora da coleta."

• Soluções estabilizadoras: existem reagentes comerciais (como RNAlater) que estabilizam o RNA em tecidos à temperatura ambiente por períodos prolongados, permitindo o transporte.

• Ambiente livre de RNAses: uso de luvas, materiais plásticos estéreis e hidrofóbicos, e superfícies tratadas com agentes que inativam RNAses.

A afirmativa também menciona "MgOH₂" e "CaCl₂". O hidróxido de magnésio (MgOH₂) é um composto pouco solúvel e não é utilizado em protocolos de preservação de RNA. O cloreto de cálcio (CaCl₂) é uma fonte de íons Ca²⁺, que, assim como Mg²⁺, são cofatores de muitas nucleases e promovem a degradação. Portanto, a presença desses sais é contraindicada para a estabilidade do RNA.

A pegadinha da banca está em inverter o conceito: em vez de apresentar um método de preservação (como baixas temperaturas ou inibidores de RNAses), ela apresenta condições que aceleram a degradação (calor e íons divalentes). O candidato que não domina a bioquímica do RNA pode ser induzido a aceitar a afirmativa como correta, por associar "aquecimento" a "esterilização" ou "estabilização". No entanto, o aquecimento a 95 °C é usado, por exemplo, para desnaturar proteínas ou para inativar DNAses, mas não para proteger RNA.

Item — ❌ ERRADO

A afirmativa está errada porque o aquecimento a 95 °C por 15 minutos, na presença de MgOH₂ e CaCl₂, degrada o RNA, não o previne. O calor intenso e os íons divalentes (Mg²⁺ e Ca²⁺) catalisam a hidrólise do RNA e potencializam a ação de RNAses. Os métodos corretos de prevenção incluem o uso de inibidores de RNAses, soluções estabilizadoras (como isotiocianato de guanidina), armazenamento em nitrogênio líquido ou a -70 °C, e manipulação em ambiente livre de RNAses. Portanto, a afirmativa contraria os princípios de preservação de RNA.

Gabarito: ERRADO (letra E).