Questão de Biomedicina - Análises Clínicas — Biologia Molecular em Biomedicina — CESPE / CEBRASPE 2025

CRISPR-Cas9: o papel da sequência PAM no reconhecimento do DNA-alvo

Gabarito: letra C (CERTO). A proteína Cas9, para realizar o corte na região desejada, depende da presença de uma sequência PAM (protospacer adjacent motif) próxima ao DNA-alvo — sem o reconhecimento do PAM, a Cas9 não consegue se ligar e clivar o DNA. Essa é uma característica fundamental do sistema CRISPR-Cas9, descrita na literatura de biologia molecular.

O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta de edição genética que permite fazer modificações precisas no DNA de organismos. Ele é composto por dois componentes principais: a proteína Cas9, que atua como uma "tesoura molecular" capaz de cortar o DNA, e um RNA guia (gRNA ou sgRNA), que direciona a Cas9 para o local exato do genoma que se deseja editar. O RNA guia possui uma sequência de aproximadamente 20 nucleotídeos complementar à sequência-alvo do DNA, garantindo a especificidade do sistema.

No entanto, a simples complementaridade entre o RNA guia e o DNA-alvo não é suficiente para que a Cas9 realize o corte. A proteína precisa reconhecer uma sequência específica adjacente ao local de clivagem, denominada PAM (protospacer adjacent motif). No caso da Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes, a sequência PAM é o trinucleotídeo NGG (onde N representa qualquer base nitrogenada). Essa sequência está localizada imediatamente após a região do DNA que será pareada com o RNA guia. A exigência do PAM é um mecanismo de segurança do sistema, pois impede que a Cas9 corte o próprio DNA da bactéria (que não possui PAM em seus arranjos CRISPR), evitando assim a autodestruição.

Na prática, quando se projeta um experimento de edição gênica, o pesquisador deve escolher uma sequência-alvo que esteja adjacente a um PAM. O RNA guia é então desenhado para ser complementar a essa sequência, e a Cas9, ao reconhecer o PAM, desenrola a dupla fita de DNA e verifica se há complementaridade com o RNA guia. Se houver, a Cas9 realiza uma quebra dupla no DNA (DSB - double-strand break), três nucleotídeos à montante do PAM. Essa quebra pode ser reparada por dois mecanismos: a junção de extremidades não homólogas (NHEJ), que geralmente resulta na inativação do gene, ou a recombinação homóloga (HR), que permite a introdução de mutações específicas quando um DNA doador é fornecido.

A exigência do PAM é um ponto crucial que distingue o CRISPR-Cas9 de outras nucleases programáveis, como as TALENs e ZFNs, que não dependem dessa sequência. Essa característica também influencia a escolha dos sítios de edição, pois nem todas as regiões do genoma possuem um PAM adjacente. Portanto, a afirmação de que a Cas9 depende da presença de uma sequência PAM próxima ao DNA-alvo está correta e reflete um dos princípios fundamentais da técnica.

Alternativa C — ✅ CERTO ⟵ GABARITO

A afirmação está correta. A proteína Cas9 reconhece a sequência PAM (protospacer adjacent motif) no DNA-alvo, que é essencial para a ativação da sua atividade endonuclease. O PAM é um trinucleotídeo (NGG para a Cas9 de Streptococcus pyogenes) localizado adjacente à sequência complementar ao RNA guia. Sem o reconhecimento do PAM, a Cas9 não consegue se ligar ao DNA e realizar o corte. Essa é uma característica intrínseca do sistema CRISPR-Cas9, amplamente descrita na literatura científica.

Alternativa E — ❌ ERRADO

A afirmação está incorreta. Ela nega a dependência da Cas9 em relação à sequência PAM, o que contraria o mecanismo de ação da técnica. A Cas9 não realiza o corte no DNA-alvo sem a presença do PAM adjacente. O PAM é um requisito para o reconhecimento e a clivagem do DNA, sendo um dos principais fatores que determinam a especificidade e a eficiência da edição gênica. Portanto, a alternativa E está errada.

Gabarito: letra C (CERTO).