Questão de Biologia — Bioinformática — CESPE / CEBRASPE 2025

Sequenciamento de RNA: PacBio e Nanopore em análises transcriptômicas

Gabarito: letra E (ERRADO). A afirmação está incorreta porque as tecnologias PacBio e Oxford Nanopore, embora sejam capazes de gerar leituras longas e sequenciar moléculas de RNA diretamente (RNA direto, sem conversão para cDNA), não são as únicas nem as mais recomendadas para identificar transcritos completos e eventos de poliadenilação alternativa — essa capacidade depende da plataforma e do protocolo, e a afirmação generaliza de forma indevida. O erro central está na palavra "recomendado" e na generalização de que essas tecnologias são a escolha padrão para tais análises, quando na prática a transcriptômica frequentemente utiliza sequenciamento de cDNA (RNA-seq) com plataformas de segunda geração (como Illumina) para quantificação, e as tecnologias de leitura longa são complementares, não exclusivas.

As técnicas "ômicas" referem-se ao estudo em larga escala de moléculas biológicas: genômica (DNA), transcriptômica (RNA), proteômica (proteínas), metabolômica (metabólitos), entre outras. A transcriptômica busca caracterizar o conjunto completo de transcritos de uma célula ou tecido, incluindo isoformas de splicing alternativo, eventos de poliadenilação alternativa e RNAs não codificadores. Para isso, o sequenciamento de RNA é uma ferramenta central.

As tecnologias de sequenciamento podem ser classificadas em gerações. A segunda geração (NGS), como Illumina e Ion Torrent, gera leituras curtas (150-300 pb) com alta precisão e é amplamente utilizada para quantificação de expressão gênica (RNA-seq). A terceira geração, como PacBio (SMRT), e a quarta geração, como Oxford Nanopore, geram leituras longas (kilobases a megabases), o que permite sequenciar moléculas inteiras de RNA ou cDNA, facilitando a resolução de isoformas completas e a identificação de eventos de poliadenilação alternativa. No entanto, essas tecnologias de leitura longa têm custo mais alto e menor precisão por base em comparação com a segunda geração, sendo frequentemente usadas para complementar, e não substituir, o RNA-seq tradicional.

A afirmação do enunciado contém uma generalização indevida ao afirmar que é "recomendado" o uso dessas tecnologias para sequenciar RNA diretamente e identificar transcritos completos. Na prática, a escolha da tecnologia depende do objetivo do estudo: para quantificação de expressão, o RNA-seq com Illumina é o padrão-ouro; para anotação de genomas e resolução de isoformas, as tecnologias de leitura longa são valiosas, mas não são a única recomendação. Além disso, o sequenciamento direto de RNA (sem conversão para cDNA) é uma capacidade específica do Nanopore, mas o PacBio geralmente requer a conversão para cDNA (ou usa o protocolo Iso-Seq, que também parte de cDNA). Portanto, a afirmação é incorreta por supergeneralizar a recomendação.

A pegadinha da banca está em apresentar uma verdade parcial (as tecnologias de leitura longa são úteis para isoformas) como uma recomendação absoluta, ignorando que a transcriptômica padrão usa cDNA e que a escolha depende do contexto. O candidato que conhece as vantagens das leituras longas pode marcar "certo" sem perceber a generalização indevida.

Item — ❌ ERRADO

A afirmação está incorreta porque generaliza a recomendação do uso de PacBio e Nanopore para sequenciar RNA diretamente e identificar transcritos completos. Embora essas tecnologias de leitura longa sejam capazes de gerar leituras que abrangem transcritos inteiros e possam sequenciar RNA diretamente (especialmente o Nanopore), a transcriptômica padrão utiliza RNA-seq com conversão para cDNA e plataformas de segunda geração (Illumina) para quantificação. A recomendação não é exclusiva nem absoluta: a escolha da tecnologia depende do objetivo (quantificação vs. anotação de isoformas), do custo e da precisão desejada. Além disso, o PacBio geralmente requer cDNA (Iso-Seq), e o sequenciamento direto de RNA é uma capacidade específica do Nanopore, não uma característica geral de ambas. Portanto, a afirmação é uma generalização indevida.

Gabarito: letra E (ERRADO).