Questão de Biologia — Moléculas, células e tecidos — FUNDATEC 2025

Cromatografia líquida: princípios de separação de biomoléculas

Gabarito: letra B — estão corretas apenas as assertivas II e III. A cromatografia de troca iônica usa o gradiente salino para competir com a proteína pelos sítios de ligação (assertiva II), e na gel-filtração as moléculas maiores são eluídas primeiro por não penetrarem nos poros da matriz (assertiva III). A assertiva I inverte a ordem de eluição da fase reversa, e a IV erra ao afirmar que a imunoafinidade independe do pH.

A cromatografia líquida é um conjunto de técnicas que separa biomoléculas com base em diferentes propriedades físico-químicas. Cada modalidade explora um princípio distinto: a fase reversa separa por hidrofobicidade, a troca iônica por carga líquida, a gel-filtração por tamanho e a imunoafinidade por reconhecimento biológico específico. Compreender o mecanismo de cada uma é essencial para escolher a técnica adequada e interpretar a ordem de eluição.

Na fase reversa, a fase estacionária é apolar (ex.: sílica ligada a grupos C18) e a fase móvel é polar (água com solventes orgânicos como acetonitrila ou metanol). Compostos apolares interagem fortemente com a fase estacionária e ficam retidos, sendo eluídos tardiamente; compostos polares interagem pouco e são eluídos primeiro. À medida que se aumenta a proporção de solvente orgânico, a fase móvel fica menos polar e compete com a fase estacionária pelos analitos apolares, promovendo sua eluição. A assertiva I inverte exatamente essa lógica.

Na troca iônica, a fase estacionária possui grupos carregados (trocadores aniônicos ou catiônicos) que atraem proteínas de carga oposta. A eluição é feita aumentando a força iônica do tampão (gradiente salino): os íons do sal competem com a proteína pelos sítios de ligação, deslocando-a da coluna. Quanto maior a carga da proteína, maior a concentração salina necessária para eluí-la.

Na gel-filtração (ou exclusão molecular), a matriz possui poros de tamanho definido. Moléculas maiores não conseguem penetrar nos poros, percorrem um caminho mais curto e são eluídas primeiro. Moléculas menores penetram nos poros, percorrem um caminho mais longo e são eluídas depois. A técnica separa por tamanho, não por afinidade.

Na imunoafinidade, a fase estacionária possui anticorpos (ou antígenos) imobilizados que reconhecem especificamente o analito. A ligação antígeno-anticorpo é altamente dependente do pH e da força iônica do tampão: condições inadequadas podem desnaturar o anticorpo, enfraquecer a interação ou até mesmo impedir a captura. O pH é um parâmetro crítico tanto na etapa de ligação quanto na de eluição (geralmente feita com tampão de pH extremo ou agente caotrópico). Portanto, a eficiência da recuperação depende diretamente das condições de pH.

Item I — ❌ Incorreto

A assertiva inverte a ordem de eluição da fase reversa. Nessa técnica, compostos apolares são retidos na fase estacionária apolar e eluídos tardiamente, enquanto compostos polares interagem pouco e são eluídos primeiro. O aumento da proporção de solvente orgânico na fase móvel reduz a polaridade da fase móvel, enfraquecendo a interação hidrofóbica e promovendo a eluição dos compostos apolares — exatamente o oposto do que afirma o item.

Item II — ✅ Correto

Na cromatografia de troca iônica, a fase estacionária carregada atrai proteínas de carga oposta. O gradiente salino aumenta a concentração de íons na fase móvel, que competem com a proteína pelos sítios de ligação na resina. À medida que a força iônica aumenta, os íons do sal deslocam a proteína, promovendo sua eluição. A assertiva descreve corretamente o mecanismo.

Item III — ✅ Correto

Na gel-filtração, a matriz porosa permite que moléculas menores penetrem nos poros, percorrendo um caminho mais longo. Moléculas maiores não penetram nos poros, percorrem um caminho mais curto e são eluídas primeiro. A assertiva está correta ao afirmar que as moléculas maiores são eluídas primeiro por não penetrarem nos poros.

Item IV — ❌ Incorreto

A imunoafinidade depende criticamente do pH. A ligação antígeno-anticorpo é influenciada pelo pH e pela força iônica: condições inadequadas podem desnaturar o anticorpo, reduzir a afinidade ou impedir a captura do analito. A eluição geralmente é feita com tampão de pH extremo (ácido ou básico) ou agente caotrópico para romper a interação. Portanto, a eficiência da recuperação depende das condições de pH, contrariando a assertiva.

Gabarito: letra B — corretas apenas as assertivas II e III.