Questão de Biologia — Moléculas, células e tecidos — FUNDATEC 2025

CRISPR-Cas9: o papel da sequência PAM

Gabarito: letra E. A sequência PAM (protospacer adjacent motif) é uma pequena sequência de DNA adjacente ao alvo, obrigatória para que a proteína Cas9 reconheça e clive o DNA-alvo. Sem a PAM, o complexo CRISPR-Cas9 não consegue se ligar ao sítio específico e a clivagem não ocorre — é o que a alternativa E afirma corretamente.

O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta de edição gênica que utiliza uma proteína (Cas9) guiada por um RNA guia (sgRNA) para gerar quebras de fita dupla em locais específicos do genoma. O RNA guia é complementar a uma sequência de aproximadamente 20 nucleotídeos do DNA-alvo, mas essa complementaridade sozinha não basta: a Cas9 só reconhece e cliva o DNA se houver, imediatamente após a sequência alvo, uma sequência curta e conservada chamada PAM. No caso da Cas9 de Streptococcus pyogenes, a PAM é a sequência 5'-NGG-3' (onde N é qualquer nucleotídeo). Essa exigência é um mecanismo de segurança: impede que a Cas9 clive o próprio DNA do sistema CRISPR (que não possui PAM adjacente às sequências espaçadoras), evitando autodestruição.

A confusão mais comum neste tema é atribuir à PAM funções que pertencem a outros componentes do sistema. A PAM não é complementar ao RNA guia (isso é função da sequência alvo), não determina o local de inserção de indels via HDR (isso é definido pelo desenho do molde de reparo e pela quebra gerada), e não é usada para reconhecimento de DNA exógeno por NHEJ (o NHEJ é um mecanismo de reparo que age após a clivagem, sem necessidade de PAM). A PAM é, exclusivamente, o requisito para o reconhecimento e a clivagem do DNA-alvo pela Cas9.

Alternativa A — ❌ Incorreta

Afirma que a PAM é utilizada para o reconhecimento de DNA exógeno por mecanismos de reparo por NHEJ. Há dois erros: (1) a PAM não é reconhecida por mecanismos de reparo, mas sim pela proteína Cas9; (2) o NHEJ (junção de extremidades não homólogas) é um mecanismo de reparo de quebras de fita dupla que atua após a clivagem, sem qualquer relação com a PAM. A PAM é um sítio de reconhecimento para a Cas9, não para o reparo.

Alternativa B — ❌ Incorreta

Afirma que a PAM determina o local de inserção de indels via HDR. O HDR (reparo dirigido por homologia) é um mecanismo de reparo que utiliza um molde de DNA homólogo para inserir uma sequência específica no local da quebra. A PAM não determina onde os indels serão inseridos; ela apenas permite que a Cas9 clive o DNA. O local da inserção é definido pela quebra gerada e pelo desenho do molde de reparo, não pela PAM.

Alternativa C — ❌ Incorreta

Afirma que a PAM define a posição exata onde ocorrerá a inserção do molde de reparo. Novamente, a PAM não tem papel na inserção do molde de reparo. O molde de reparo (usado em HDR) é desenhado com sequências homólogas às regiões flanqueadoras do local da quebra, e a inserção ocorre nesse local, independentemente da PAM. A PAM apenas possibilita a clivagem inicial.

Alternativa D — ❌ Incorreta

Afirma que a PAM atua como região complementar ao RNA guia, facilitando o pareamento. Isso é incorreto: a região complementar ao RNA guia é a sequência alvo de 20 nucleotídeos no DNA, não a PAM. A PAM é uma sequência adjacente ao alvo, reconhecida pela proteína Cas9, e não pelo RNA guia. O pareamento RNA guia-DNA ocorre na região alvo, e a PAM é um requisito adicional para a ativação da Cas9.

Alternativa E — ✅ Correta ⟵ GABARITO

Afirma que a PAM é obrigatória para o reconhecimento e clivagem do DNA-alvo. Isso está correto: a Cas9 só reconhece e cliva o DNA se houver uma PAM adjacente à sequência alvo. Sem a PAM, o complexo CRISPR-Cas9 não se liga ao sítio e a clivagem não ocorre. Essa é a função central da PAM no sistema.

Gabarito: letra E.