Questão de Biologia — Moléculas, células e tecidos — FUNDATEC 2025

Transformação bacteriana por choque térmico com CaCl₂

Gabarito: letra E. O choque térmico, precedido do tratamento com CaCl₂, é o procedimento clássico para tornar bactérias competentes e permitir a entrada do DNA plasmidial: os íons Ca²⁺ neutralizam as cargas negativas da membrana e do DNA, e o aumento de temperatura (42 °C) cria um gradiente osmótico temporário que favorece a passagem do plasmídeo através da membrana celular. As demais alternativas atribuem funções incorretas ao aquecimento, ao CaCl₂ ou ao antibiótico.

A transformação bacteriana é uma das três vias de introdução de DNA recombinante em células bacterianas (as outras são transdução e infecção). No método descrito, as bactérias são incubadas em solução de cloreto de cálcio para se tornarem competentes — ou seja, capazes de absorver o DNA do meio. O Ca²⁺ atua neutralizando as cargas negativas tanto da membrana bacteriana quanto do DNA (que é um ácido nucleico, portanto carregado negativamente), reduzindo a repulsão eletrostática. Em seguida, o choque térmico (geralmente 42 °C por 30–90 segundos) aumenta a fluidez da membrana e cria um gradiente osmótico temporário que permite a entrada do plasmídeo. Depois de entrar, o DNA plasmidial se estabelece como um cromossomo extracromossômico e se replica independentemente do cromossomo bacteriano.

A seleção em meio com antibiótico é uma etapa posterior e crucial: apenas as bactérias que incorporaram o plasmídeo (que carrega o gene de resistência ao antibiótico) conseguem crescer. Isso explica por que colônias aparecem apenas nas placas com o plasmídeo — as bactérias sem o plasmídeo morrem no meio seletivo.

A pegadinha central da questão está em atribuir ao aquecimento ou ao CaCl₂ funções que eles não têm: o aquecimento não desnatura o DNA plasmidial (isso o destruiria), não ativa DNA ligase bacteriana (a ligase não é ativada por calor e o plasmídeo não se integra ao genoma — permanece extracromossômico), e o CaCl₂ não induz replicação plasmidial. O antibiótico, por sua vez, não induz promotor — ele apenas seleciona as células transformadas.

Alternativa A — ❌ Incorreta

O aquecimento a 42 °C não desnatura o DNA plasmidial — pelo contrário, desnaturaria o DNA e inviabilizaria a clonagem. O choque térmico tem a função de aumentar a permeabilidade da membrana e criar o gradiente osmótico que permite a entrada do DNA. A desnaturação do DNA é um processo usado em outras técnicas (como PCR), mas não aqui.

Alternativa B — ❌ Incorreta

O CaCl₂ não induz replicação plasmidial nem estabiliza o DNA durante a inserção. Sua função é neutralizar as cargas negativas da membrana e do DNA, facilitando a aproximação e a entrada do plasmídeo. A replicação do plasmídeo ocorre depois, dentro da célula, por mecanismos próprios (origem de replicação).

Alternativa C — ❌ Incorreta

O aquecimento não ativa a DNA ligase bacteriana e o plasmídeo não se integra ao genoma da célula hospedeira. Em clonagem molecular, o plasmídeo permanece como um elemento extracromossômico (epissomo) que se replica de forma autônoma. A integração ao genoma é um evento raro e não é o objetivo da transformação com plasmídeo.

Alternativa D — ❌ Incorreta

A seleção em meio com antibiótico não visa induzir o promotor do gene inserido. O antibiótico atua como agente seletivo: apenas as bactérias que adquiriram o plasmídeo (que contém gene de resistência ao antibiótico) sobrevivem. A indução do promotor é uma etapa separada, geralmente feita com moléculas indutoras (como IPTG), e não tem relação com a seleção.

Alternativa E — ✅ Correta ⟵ GABARITO

Esta alternativa descreve corretamente o mecanismo: o choque térmico cria um gradiente osmótico temporário que permite a entrada do DNA plasmidial através da membrana celular, após a neutralização das cargas negativas pelo Ca²⁺. O CaCl₂ torna as células competentes ao neutralizar as cargas negativas da membrana e do DNA, e o choque térmico (42 °C) aumenta a fluidez da membrana, facilitando a passagem do plasmídeo.

Gabarito: letra E