Questão de Biologia — Transcrição e Tradução — FUNDATEC 2025

Sequenciamento de Nova Geração (NGS): tecnologias e etapas

Gabarito: letra A — sequência V – V – F – V. As duas primeiras assertivas descrevem corretamente as plataformas Illumina (detecção por fluorescência) e Ion S5 (detecção por variação de pH) e a vantagem das long reads na montagem de genomas de novo; a terceira é falsa porque a PCR não é obrigatória em todas as tecnologias NGS (há métodos que sequenciam molécula única, como PacBio e Nanopore); a quarta é verdadeira, pois o demultiplexing separa as leituras por amostra na análise secundária.

O sequenciamento de nova geração (NGS) reúne tecnologias de alto rendimento que sequenciam milhões de fragmentos de DNA em paralelo, revolucionando a genômica. As plataformas de segunda geração, como Illumina e Ion Torrent (Ion S5), dependem da amplificação em ponte ou em emulsão (PCR) para gerar clusters ou beads com milhares de cópias do mesmo fragmento, e detectam a incorporação de nucleotídeos de formas distintas: a Illumina usa nucleotídeos marcados com corantes fluorescentes, enquanto o Ion Torrent detecta a liberação de íons H+ (mudança de pH) durante a polimerização. Já as tecnologias de terceira geração (PacBio e Oxford Nanopore) sequenciam moléculas únicas de DNA, sem necessidade de amplificação prévia, produzindo leituras muito longas (long reads) — ideais para montagem de genomas de novo, pois atravessam regiões repetitivas e complexas. A análise dos dados gerados envolve etapas primárias (controle de qualidade, trimagem), secundárias (alinhamento, demultiplexing) e terciárias (interpretação biológica).

Assertiva 1 — ✅ Verdadeira

A assertiva está correta. As plataformas Illumina e Ion S5 são, de fato, exemplos de NGS de segunda geração, e diferenciam-se no método de detecção da incorporação de nucleotídeos. A Illumina utiliza nucleotídeos marcados com corantes fluorescentes, detectando a fluorescência emitida a cada incorporação. O Ion S5 (Ion Torrent) detecta a variação de pH resultante da liberação de íons H+ durante a polimerização. O texto de apoio confirma: "Na maioria dos sequenciamentos, parte-se do princípio que a DNA polimerase irá adicionar nucleotídeos em uma fita de DNA complementar a uma fita molde... No método Ion Torrent, vários segmentos de DNA a serem sequenciados estão dispostos em um chip contendo um sensor que detecta essa variação no pH e uma DNA polimerase." E sobre a Illumina: "Cada um dos quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídios, dATP, dGTP, dTTP e dCTP, é marcado com um diferente corante fluorescente que emite um sinal em diferentes comprimentos de onda."

Assertiva 2 — ✅ Verdadeira

A assertiva está correta. O sequenciamento de long reads é ideal para a montagem de genomas de novo, pois a capacidade de ler fragmentos de dezenas a centenas de milhares de pares de bases ajuda a resolver regiões complexas e repetitivas. O texto de apoio afirma: "Os métodos de terceira geração, como os desenvolvidos por Pacific Biosciences (PacBio) e Oxford Nanopore Technologies, oferecem algumas vantagens sobre os métodos de sequenciamento de segunda geração, como o Illumina. Eles incluem a capacidade de gerar leituras de sequências muito longas, o que prontamente possibilita a montagem de genomas completos." As long reads conseguem atravessar regiões repetitivas que confundem as short reads, permitindo uma montagem mais contígua e precisa.

Assertiva 3 — ❌ Falsa

A assertiva está incorreta. A PCR não é um passo obrigatório para todas as tecnologias de NGS. Embora as plataformas de segunda geração (Illumina, Ion Torrent, 454 Roche) dependam de amplificação por PCR (em ponte ou em emulsão) para gerar clusters ou beads, as tecnologias de terceira geração (PacBio e Oxford Nanopore) sequenciam moléculas únicas de DNA, sem necessidade de amplificação prévia. O texto de apoio confirma: "Recentemente, foram desenvolvidas as chamadas tecnologias de sequenciamento de 'terceira geração', possibilitando o sequenciamento de moléculas únicas de DNA." E sobre o Nanopore: "Não há incorporação de nucleotídeos nessa metodologia e a sua praticidade permite que sequenciamentos sejam realizados de maneira rápida em qualquer ambiente sem a necessidade de muitos recursos." Portanto, a PCR é necessária em algumas plataformas, mas não em todas.

Assertiva 4 — ✅ Verdadeira

A assertiva está correta. O demultiplexing é uma etapa da análise secundária, em que as leituras de cada amostra são separadas em arquivos individuais, o que é fundamental para a análise subsequente. No NGS, múltiplas amostras são sequenciadas simultaneamente em uma mesma corrida, cada uma identificada por um índice ou barcode específico. O demultiplexing utiliza esses índices para atribuir cada leitura à amostra correta, gerando arquivos separados (geralmente em formato FASTQ) para cada amostra. Essa etapa é essencial para que as análises posteriores (alinhamento, chamada de variantes, etc.) sejam realizadas corretamente para cada amostra individual.

Conclusão: Corretas: 1, 2 e 4 → portanto a alternativa é a letra A (V – V – F – V).

Gabarito: letra A