Questão de Biologia — Núcleo interfásico e código genético — FUNDATEC 2025

Extração de ácidos nucleicos: precipitação com etanol e acetato de sódio

Gabarito: letra E. A adição de acetato de sódio e etanol após a extração com fenol-clorofórmio tem como principal função promover a precipitação seletiva dos ácidos nucleicos. O sal fornece cátions que neutralizam as cargas negativas do fosfato, e o etanol desidrata as moléculas, reduzindo sua solubilidade e fazendo-as precipitar — é o princípio clássico de precipitação alcoólica de DNA/RNA.

A extração com fenol-clorofórmio é um método clássico de purificação de ácidos nucleicos. O fenol desnatura proteínas e o clorofórmio ajuda a separar as fases aquosa e orgânica, deixando os ácidos nucleicos na fase aquosa. Após essa separação, é necessário concentrar e purificar o DNA/RNA, removendo sais e outros contaminantes. É aí que entra a etapa de precipitação: o acetato de sódio (ou outro sal, como cloreto de sódio) fornece íons Na⁺ que se ligam aos grupos fosfato (negativos) do ácido nucleico, neutralizando a carga. O etanol, por ser um solvente orgânico miscível em água, reduz a constante dielétrica do meio, enfraquecendo as interações entre as moléculas de água e o ácido nucleico. Com a carga neutralizada e a hidratação reduzida, as moléculas de DNA/RNA perdem a solubilidade e se agregam, formando um precipitado que pode ser recuperado por centrifugação. Esse é o fundamento da precipitação alcoólica, uma técnica universal em biologia molecular.

A pegadinha da questão está em confundir essa etapa com outras funções do processo de extração. A desnaturação de proteínas é feita pelo fenol, não pelo etanol/acetato. A remoção de sais caotrópicos (como tiocianato de guanidina) é típica de kits de coluna de sílica, não do método fenol-clorofórmio. A inibição de RNases é feita com inibidores específicos (como DEPC ou inibidores proteicos), não com etanol. E a estabilização do DNA em solução aquosa é feita por tampões (como TE), não pela precipitação. A precipitação, na verdade, remove o DNA da solução aquosa, permitindo sua ressuspensão em um volume menor e em um tampão adequado.

Alternativa A — ❌ Incorreta

A desnaturação de proteínas residuais é função do fenol na etapa de extração, não do acetato de sódio/etanol. O fenol desnatura proteínas por quebrar suas estruturas terciárias, fazendo-as migrar para a fase orgânica. O etanol, por sua vez, não desnatura proteínas de forma relevante nesse contexto — ele precipita ácidos nucleicos.

Alternativa B — ❌ Incorreta

A redução de sais caotrópicos (como tiocianato de guanidina) é uma etapa de kits de purificação por coluna de sílica, onde esses sais são usados para ligar o DNA à sílica e depois são lavados. No método fenol-clorofórmio, não há uso de sais caotrópicos; a precipitação com etanol/acetato serve para concentrar os ácidos nucleicos, não para remover esse tipo específico de contaminante.

Alternativa C — ❌ Incorreta

A prevenção da degradação de RNA por RNases é feita com inibidores de RNase (como DEPC, que inativa as enzimas, ou inibidores proteicos como RNasin). O etanol e o acetato de sódio não têm essa função. Na verdade, o etanol pode até precipitar o RNA, protegendo-o temporariamente, mas não inibe a atividade das RNases.

Alternativa D — ❌ Incorreta

A estabilização do DNA em solução aquosa é feita com tampões como TE (Tris-EDTA), que mantêm o pH e quelam íons metálicos (o EDTA sequestra Mg²⁺, cofator de nucleases). A precipitação com etanol/acetato, ao contrário, remove o DNA da solução aquosa, fazendo-o precipitar — não o estabiliza em solução.

Alternativa E — ✅ Correta ⟵ GABARITO

A função principal é promover a precipitação seletiva dos ácidos nucleicos. O acetato de sódio fornece cátions Na⁺ que neutralizam as cargas negativas dos grupos fosfato, e o etanol reduz a solubilidade do DNA/RNA, fazendo-os precipitar. Esse é o princípio da precipitação alcoólica, usado para concentrar e purificar ácidos nucleicos após a extração.

Gabarito: letra E