Questão de Medicina — Pediatria e Neonatologia — INSTITUTO AOCP 2026

Diagnóstico genético: MLPA na detecção de deleções multiexônicas

Gabarito: letra D. A MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) é a técnica mais apropriada como próxima etapa diagnóstica, pois é o padrão-ouro para detecção de variações do número de cópias (CNVs), incluindo deleções em heterozigose que envolvem múltiplos éxons de um gene único. O sequenciamento Sanger não identifica esse tipo de alteração, pois ele não quantifica o número de cópias alélicas — apenas lê a sequência de nucleotídeos. A MLPA preenche exatamente essa lacuna diagnóstica.

A suspeita clínica de uma síndrome genética por deleção em heterozigose de múltiplos éxons aponta para uma variação estrutural que altera a dosagem gênica. O Sanger, ao sequenciar os fragmentos, não consegue distinguir se uma das cópias do gene está ausente, pois ele não fornece informação quantitativa confiável sobre o número de alelos presentes. É aqui que entra a MLPA: ela combina a hibridização de sondas específicas com a amplificação por PCR e a análise dos fragmentos por eletroforese capilar, permitindo quantificar com precisão o número de cópias de cada éxon testado. Quando há deleção em heterozigose, a razão entre o sinal da sonda do éxon deletado e o de uma sonda controle (de uma região normal) cai para aproximadamente 0,5, revelando a perda de uma cópia.

A MLPA é amplamente utilizada na prática clínica para o diagnóstico de diversas doenças genéticas, como a atrofia muscular espinhal (AME), a síndrome de Charcot-Marie-Tooth tipo 1A, a distrofia muscular de Duchenne/Becker e a síndrome de Williams-Beuren, entre outras. No caso da AME, por exemplo, a deleção homozigótica dos éxons 7 e 8 do gene SMN1 é a causa mais comum, e a MLPA é um dos métodos de escolha para confirmar o diagnóstico, pois detecta tanto a deleção homozigótica quanto a heterozigótica e ainda quantifica o número de cópias do gene SMN2, que é um modificador fenotípico importante. Essa capacidade de quantificar múltiplos éxons simultaneamente em uma única reação é o que torna a MLPA superior a outras técnicas para esse fim.

A distinção crucial que separa as alternativas é a natureza da alteração genética: deleção multiexônica em heterozigose é uma variação do número de cópias (CNV), e não uma variante de sequência pontual. Técnicas que apenas leem a sequência (Sanger, sequenciamento de nova geração) ou que medem expressão gênica (microarranjo de expressão) não são adequadas para detectar CNVs. A PCR convencional e a PCR em tempo real quantitativa (qPCR) podem, em tese, detectar deleções, mas a MLPA é o padrão-ouro por sua capacidade de multiplexar dezenas de sondas em uma única reação, com alta sensibilidade e especificidade, e por ser menos suscetível a variações de eficiência de amplificação que afetam a qPCR. É exatamente nessa fronteira — detecção de CNVs multiexônicas — que as alternativas se dividem.

Alternativa A — ❌ Incorreta

A PCR convencional é uma técnica qualitativa que amplifica um fragmento específico de DNA. Ela não é capaz de quantificar o número de cópias de um gene, sendo inadequada para detectar uma deleção em heterozigose. Em uma deleção heterozigótica, a PCR convencional ainda amplificaria o alelo normal, gerando um produto de PCR aparentemente normal, sem revelar a perda do outro alelo. A técnica não fornece informação de dosagem gênica.

Alternativa B — ❌ Incorreta

O sequenciamento de nova geração (NGS) do exoma completo é excelente para detectar variantes de sequência (mutações de ponto, pequenas inserções/deleções), mas tem limitações na detecção de variações do número de cópias (CNVs), especialmente deleções que envolvem múltiplos éxons. Embora existam ferramentas de bioinformática que tentam inferir CNVs a partir de dados de NGS, a sensibilidade e a especificidade são inferiores às da MLPA, que é o método dedicado e validado para essa finalidade. Além disso, o NGS é mais caro e demorado, sendo desnecessário quando a suspeita é de uma deleção multiexônica em um gene conhecido.

Alternativa C — ❌ Incorreta

O microarranjo de expressão gênica (microarray de expressão) mede os níveis de RNA mensageiro (mRNA) transcrito de milhares de genes simultaneamente. Ele avalia a expressão gênica, não a estrutura do DNA. Uma deleção em heterozigose pode ou não alterar os níveis de mRNA, e essa alteração não é específica nem confiável para o diagnóstico de CNVs. Além disso, o microarray de expressão é influenciado por muitos fatores (tipo celular, condições de coleta, regulação pós-transcricional), tornando-o inadequado como teste diagnóstico para deleções gênicas.

Alternativa D — ✅ Correta ⟵ GABARITO

A MLPA é a técnica padrão-ouro para detecção de variações do número de cópias (CNVs), incluindo deleções e duplicações que envolvem um ou múltiplos éxons. Ela funciona por meio da hibridização de sondas específicas para cada éxon de interesse, seguidas de ligação, amplificação por PCR e análise por eletroforese capilar. A quantidade de produto amplificado é proporcional ao número de cópias da sequência alvo, permitindo identificar deleções em heterozigose (razão de 0,5) ou homozigose (razão de 0). No caso descrito, em que o Sanger não identificou variantes patogênicas e há suspeita de deleção multiexônica em heterozigose, a MLPA é a escolha mais apropriada, pois detecta exatamente esse tipo de alteração com alta sensibilidade e especificidade.

Alternativa E — ❌ Incorreta

A PCR em tempo real quantitativa (qPCR) pode, em tese, detectar deleções por meio da quantificação relativa do número de cópias, comparando o gene alvo com um gene de referência. No entanto, a qPCR tem limitações importantes: ela analisa um único alvo por reação (ou poucos, em multiplex limitado), é mais suscetível a variações na eficiência de amplificação e requer curvas de calibração cuidadosas. A MLPA é superior por permitir a análise simultânea de dezenas de éxons em uma única reação, com controles internos robustos e maior reprodutibilidade, sendo por isso considerada o padrão-ouro para essa finalidade.

Gabarito: letra D — a MLPA é a técnica padrão-ouro para detecção de deleções multiexônicas em heterozigose.