Questão de Farmácia — Biologia Molecular e Biotecnologia — VUNESP 2025

Alfacomplementação e seleção de clones recombinantes

Gabarito: letra B. Em vetores do tipo pUC, o gene de interesse é inserido dentro da sequência que codifica a subunidade α da β-galactosidase (lacZ-α), interrompendo seu quadro de leitura. Quando a bactéria hospedeira expressa a subunidade complementar (lacZ-ω), a enzima funcional só é reconstituída se a lacZ-α estiver íntegra. Assim, colônias brancas indicam clones recombinantes, pois a inserção do inserto quebrou a lacZ-α e impediu a alfacomplementação — exatamente o que a alternativa B afirma.

A alfacomplementação é a base do sistema de seleção azul/branco, uma das ferramentas mais usadas em clonagem molecular. O vetor carrega um fragmento do gene lacZ que codifica o peptídeo α (os primeiros ~146 aminoácidos da β-galactosidase). A cepa hospedeira, por sua vez, carrega no cromossomo uma versão mutante do gene lacZ que produz o peptídeo ω (o restante da enzima, sem o fragmento N-terminal). Nenhum dos dois fragmentos é ativo sozinho; a atividade enzimática só aparece quando os dois peptídeos se associam no citoplasma e reconstituem a β-galactosidase funcional. Esse fenômeno é a alfacomplementação.

O vetor possui, dentro da sequência da lacZ-α, um sítio de clonagem múltipla (MCS, ou poliligante) — uma região com vários sítios únicos de restrição. Quando o gene de interesse é inserido no MCS, ele interrompe a sequência da lacZ-α, quebrando o quadro de leitura e impedindo a produção do peptídeo α funcional. Sem o peptídeo α, não há alfacomplementação e a enzima não é reconstituída.

O meio de cultura contém X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo), um substrato cromogênico da β-galactosidase. Quando a enzima está ativa, ela cliva o X-gal, gerando um produto azul insolúvel que cora a colônia. Portanto:

• Colônias azuis = β-galactosidase ativa = lacZ-α íntegra = vetor sem inserto (clone não recombinante).

• Colônias brancas = β-galactosidase inativa = lacZ-α interrompida = vetor com inserto (clone recombinante).

A ampicilina no meio serve apenas para selecionar as bactérias que receberam o vetor (aquelas que carregam o gene de resistência ampR). Ela não tem relação com a cor das colônias. O sistema azul/branco é uma triagem (screen) para distinguir recombinantes de não recombinantes, enquanto a resistência a antibiótico é uma seleção (selection) para eliminar bactérias sem vetor.

A pegadinha clássica desta questão é inverter a lógica: muitos candidatos associam "colônia colorida" a "algo aconteceu" e marcam azul como recombinante. Mas o raciocínio é o oposto: a cor azul indica que a enzima está funcionando, logo o gene lacZ-α está intacto, logo NÃO houve inserção. A interrupção do gene é justamente o que produz a cor branca.

Guarde o par: inserção no MCS → lacZ-α quebrada → sem alfacomplementação → colônia branca. É esse critério que separa as alternativas corretas das incorretas.

Alternativa A — ❌ Incorreta

Afirma que clones recombinantes apresentam colônias azuis devido à manutenção da atividade da β-galactosidase. O erro está na cor: clones recombinantes são brancos, pois a inserção do gene de interesse interrompe a lacZ-α e inativa a β-galactosidase. A cor azul indica exatamente o oposto — vetor sem inserto, com lacZ-α íntegra e enzima ativa.

Alternativa B — ✅ Correta ⟵ GABARITO

Correta. A inserção do gene de interesse no sítio múltiplo de clonagem (MCS), localizado dentro da sequência da lacZ-α, interrompe o quadro de leitura dessa subunidade. Sem o peptídeo α funcional, não ocorre alfacomplementação com a subunidade ω da cepa hospedeira, a β-galactosidase não é reconstituída e o X-gal não é clivado — resultando em colônias brancas. É exatamente o que a alternativa descreve.

Alternativa C — ❌ Incorreta

Afirma que clones recombinantes são azuis devido à inserção no MCS da região lacZ. O erro está na cor: a inserção no MCS interrompe a lacZ-α, impedindo a alfacomplementação e gerando colônias brancas, não azuis. A cor azul indicaria lacZ-α intacta, ou seja, vetor sem inserto.

Alternativa D — ❌ Incorreta

Afirma que clones recombinantes são brancos devido à repressão da expressão do gene de resistência. O erro está na causa: a cor branca decorre da interrupção da lacZ-α pela inserção do inserto, não da repressão do gene de resistência à ampicilina. O gene de resistência (ampR) permanece expresso — é ele que permite que a bactéria cresça no meio com ampicilina. A cor da colônia é determinada exclusivamente pela atividade da β-galactosidase sobre o X-gal.

Alternativa E — ❌ Incorreta

Afirma que clones recombinantes são azuis devido à expressão aumentada do sistema lac em presença de X-gal. O erro é duplo: (1) clones recombinantes são brancos, não azuis; (2) o X-gal é apenas um substrato cromogênico — ele não induz a expressão do sistema lac. A expressão do sistema lac é regulada por outros mecanismos (como o operon lac e a presença de IPTG, um indutor), não pelo X-gal. A cor azul, quando ocorre, é consequência da atividade enzimática sobre o X-gal, não da sua presença.

Gabarito: letra B — colônias brancas, devido à interrupção do quadro de leitura da subunidade lacZ-α.