Questão de Biomedicina - Análises Clínicas — Biologia Molecular em Biomedicina — VUNESP 2025

Sequenciamento de DNA pelo método de Sanger

Gabarito: letra A. O método de Sanger, também chamado de método de terminação de cadeia, tem como reagente principal e singular os didesoxirribonucleotídeos trifosfatados (ddNTPs), que são análogos dos desoxirribonucleotídeos normais, porém sem o grupo hidroxila (OH) no carbono 3' da pentose, o que interrompe a síntese da fita de DNA quando incorporados pela DNA polimerase. Essa característica é o que permite a geração de fragmentos de diferentes tamanhos, cuja análise revela a sequência de bases.

O sequenciamento de DNA é uma técnica fundamental da biologia molecular que determina a ordem exata dos nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) em uma molécula de DNA. O método desenvolvido por Frederick Sanger em 1977 revolucionou a genética e, com modificações, ainda é amplamente utilizado, especialmente para sequenciar fragmentos de até cerca de 900 pares de bases. A essência do método está no uso de nucleotídeos modificados, os ddNTPs, que atuam como "terminadores de cadeia".

Para entender por que os ddNTPs são tão especiais, é preciso compará-los com os nucleotídeos comuns. Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs) possuem um grupo OH no carbono 3' da desoxirribose, que é o ponto de ligação para o próximo nucleotídeo durante a síntese da fita. Já os ddNTPs não possuem esse grupo OH, pois têm um átomo de hidrogênio no lugar. Quando a DNA polimerase incorpora um ddNTP na fita em crescimento, a ausência do 3'-OH impede a formação da próxima ligação fosfodiéster, e a extensão da cadeia é interrompida imediatamente. Essa interrupção é o que gera fragmentos de DNA de comprimentos variados, cada um terminando em uma base específica.

Na prática, a reação de sequenciamento contém o DNA molde, um primer, a DNA polimerase, os quatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) e uma pequena quantidade de cada um dos quatro ddNTPs, cada um marcado com um corante fluorescente de cor diferente. Como os ddNTPs estão em menor concentração, eles são incorporados aleatoriamente em vez dos dNTPs, produzindo uma mistura de fragmentos que terminam em cada posição da sequência. Esses fragmentos são então separados por eletroforese capilar, e a ordem dos corantes fluorescentes revela a sequência de bases do DNA.

A pegadinha desta questão está em distinguir os ddNTPs dos dNTPs e de outros nucleotídeos. Os dNTPs são os blocos de construção normais do DNA, usados em todas as reações de polimerização, inclusive na PCR. Os ddNTPs são exclusivos do sequenciamento de Sanger, pois são os terminadores de cadeia. A transcriptase reversa é uma enzima que sintetiza DNA a partir de RNA, usada em técnicas como RT-PCR, mas não é um reagente do sequenciamento de Sanger. A luciferase é uma enzima que catalisa a emissão de luz, utilizada no sequenciamento por síntese (pirosequenciamento), uma técnica de nova geração, mas não no método de Sanger. Os ribonucleotídeos são os blocos de construção do RNA, não do DNA, e não participam do sequenciamento de Sanger.

Guarde a distinção central: o que torna o método de Sanger único é o uso de ddNTPs, os terminadores de cadeia. É exatamente essa singularidade que a alternativa correta destaca, e é nela que as alternativas incorretas tentam confundir.

Alternativa A — ✅ Correta ⟵ GABARITO

A alternativa está correta porque os didesoxirribonucleotídeos trifosfatados (ddNTPs) são o reagente principal e singular do método de Sanger. Eles são análogos dos dNTPs, mas sem o grupo 3'-OH, o que interrompe a síntese da fita de DNA quando incorporados. Essa interrupção gera fragmentos de tamanhos variados, cuja análise por eletroforese revela a sequência de bases. O contexto descreve exatamente isso: "O método consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxiribonucleotídeos (ddNTP's), que não possuem o grupo OH livre do carbono 3' da pentose, e impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição."

Alternativa B — ❌ Incorreta

A alternativa menciona "desoxirribonucleotídeos difosfatados", mas esse composto não é utilizado no sequenciamento de Sanger. Os nucleotídeos usados na síntese de DNA são trifosfatados (dNTPs), pois a energia da hidrólise dos fosfatos é necessária para a formação da ligação fosfodiéster. A forma difosfatada não é um substrato natural da DNA polimerase e não participa da reação. A banca trocou o número de fosfatos para confundir o candidato.

Alternativa C — ❌ Incorreta

A transcriptase reversa é uma enzima que sintetiza DNA a partir de RNA, sendo utilizada em técnicas como RT-PCR e na clonagem de cDNA. No método de Sanger, a enzima utilizada é a DNA polimerase, que sintetiza DNA a partir de DNA molde. A transcriptase reversa não é um reagente do sequenciamento de Sanger, pois o método não envolve a transcrição reversa de RNA.

Alternativa D — ❌ Incorreta

Os ribonucleotídeos difosfatados são blocos de construção do RNA, não do DNA. No sequenciamento de Sanger, os nucleotídeos utilizados são desoxirribonucleotídeos (dNTPs), que possuem a desoxirribose como açúcar. Além disso, a forma difosfatada não é a utilizada na síntese de ácidos nucleicos, que requer trifosfatos. Portanto, essa alternativa está duplamente incorreta: pelo tipo de açúcar e pelo número de fosfatos.

Alternativa E — ❌ Incorreta

A luciferase é uma enzima que catalisa a oxidação da luciferina, produzindo luz. Ela é utilizada no pirosequenciamento, uma técnica de sequenciamento de nova geração que detecta a liberação de pirofosfato durante a incorporação de nucleotídeos, gerando um sinal luminoso. No método de Sanger, a detecção é feita por fluorescência dos ddNTPs marcados, não por bioluminescência. Portanto, a luciferase não é um reagente do método de Sanger.

Gabarito: letra A