Questão de Medicina — Genética Médica — VUNESP 2025

Sequenciamento de DNA: o método de Sanger

Gabarito: letra E. A primeira técnica capaz de identificar a sequência exata de nucleotídeos em uma molécula de DNA foi o Método de Sanger, desenvolvido por Frederick Sanger em 1977, também conhecido como sequenciamento por terminação de cadeia. As demais alternativas são técnicas importantes, mas não realizam sequenciamento: PCR amplifica, Southern blot detecta, ELISA identifica proteínas e eletroforese separa fragmentos.

O sequenciamento de DNA é o processo de determinar a ordem exata dos nucleotídeos (adenina, timina, citosina e guanina) em uma molécula de DNA. Essa informação é fundamental para a genética, pois é a sequência de bases que codifica as instruções para a vida. Antes de 1977, os cientistas conseguiam analisar proteínas e até mesmo o DNA de forma indireta, mas não conseguiam "ler" a sequência de nucleotídeos diretamente.

O método de Sanger revolucionou a biologia molecular ao permitir essa leitura. A técnica se baseia na síntese de novas fitas de DNA a partir de uma fita molde, mas com um truque engenhoso: utiliza nucleotídeos modificados (dididesoxinucleotídeos, ddNTPs) que, quando incorporados à fita em crescimento, impedem a adição de qualquer nucleotídeo seguinte, terminando a síntese naquele ponto. Ao realizar a reação em quatro tubos separados, cada um com um tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), são gerados fragmentos de todos os tamanhos possíveis, cada um terminando em uma base específica. Esses fragmentos são então separados por eletroforese, e a ordem das bases é lida do menor para o maior fragmento.

Na prática, imagine que você quer sequenciar um pequeno trecho de DNA com a sequência "AGTC". Na reação com ddATP, você obteria fragmentos terminando em A; na com ddTTP, fragmentos terminando em T, e assim por diante. Ao separar todos os fragmentos por tamanho, a ordem dos tamanhos revela a sequência: o menor fragmento termina na primeira base (A), o próximo na segunda (G), e assim sucessivamente.

A confusão mais comum neste tema é misturar as funções das técnicas de biologia molecular. Enquanto o sequenciamento (Sanger) determina a ordem das bases, a PCR amplifica uma região específica do DNA, o Southern blot detecta a presença de uma sequência específica em uma amostra, o ELISA detecta proteínas (antígenos ou anticorpos) e a eletroforese separa moléculas por tamanho e carga. A banca explora exatamente essa distinção: todas as alternativas são técnicas reais de laboratório, mas apenas uma realiza o sequenciamento.

Guarde a função de cada técnica: é exatamente nessa fronteira que as alternativas se dividem.

Alternativa A — ❌ Incorreta

A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica de amplificação de DNA, que permite quantificar a quantidade de um segmento específico de DNA em uma amostra. Ela não determina a sequência de nucleotídeos; apenas copia exponencialmente uma região-alvo definida por primers. O erro está em confundir amplificação com sequenciamento.

Alternativa B — ❌ Incorreta

O Southern blot é uma técnica de detecção de sequências específicas de DNA em uma amostra, utilizando sondas marcadas. Ele permite verificar se um gene está presente, mas não revela a ordem exata dos nucleotídeos. A confusão aqui é entre detectar a presença de uma sequência e ler a sequência completa.

Alternativa C — ❌ Incorreta

A reação de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é uma técnica imunoenzimática utilizada para detectar e quantificar proteínas, anticorpos ou antígenos em uma amostra. Ela não tem relação com a leitura da sequência de DNA. O erro está em associar uma técnica de detecção de proteínas ao sequenciamento de ácidos nucleicos.

Alternativa D — ❌ Incorreta

A eletroforese em gel de agarose é uma técnica de separação de moléculas (DNA, RNA ou proteínas) com base em seu tamanho e carga elétrica. Ela é uma ferramenta auxiliar em diversas técnicas, incluindo o próprio sequenciamento de Sanger (para separar os fragmentos), mas por si só não determina a sequência de nucleotídeos. O erro está em confundir uma etapa do processo com a técnica completa.

Alternativa E — ✅ Correta ⟵ GABARITO

O Método de Sanger, desenvolvido por Frederick Sanger em 1977, foi a primeira técnica capaz de determinar a sequência exata de nucleotídeos de uma molécula de DNA. Também chamado de sequenciamento por terminação de cadeia, o método utiliza didesoxinucleotídeos para gerar fragmentos de diferentes tamanhos, que são separados por eletroforese para revelar a ordem das bases. Essa técnica foi fundamental para o desenvolvimento da biologia molecular e abriu caminho para projetos como o Genoma Humano.

Gabarito: letra E