Questão de Medicina — Genética Médica — VUNESP 2025

Diagnóstico molecular da Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)

Gabarito: letra E. Após a PCR multiplex indicar a ausência dos éxons 45 a 50 do gene DMD, o próximo passo mais adequado é a MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), técnica quantitativa que confirma a deleção e determina sua extensão precisa, permitindo a correlação genótipo-fenótipo. A PCR multiplex é qualitativa e pode falhar na amplificação de um alelo por polimorfismos na região de anelamento dos iniciadores; a MLPA, por usar sondas que hibridizam e são ligadas antes da amplificação, fornece uma medida semiquantitativa do número de cópias de cada éxon, sendo o padrão-ouro para detectar deleções e duplicações no gene DMD.

A distrofia muscular de Duchenne é uma doença ligada ao cromossomo X, causada por mutações no gene DMD, que codifica a distrofina, uma proteína do citoesqueleto subsarcolemal essencial para a estabilidade da membrana muscular durante a contração. As deleções de um ou mais éxons são a causa mais comum da doença, correspondendo a cerca de 60-70% dos casos. A PCR multiplex é uma técnica de triagem que amplifica simultaneamente vários éxons do gene, mas tem limitações importantes: ela é qualitativa (presença ou ausência do produto de PCR), não detecta duplicações e pode gerar falsos negativos se houver polimorfismos nos sítios de anelamento dos primers. Por isso, quando a PCR multiplex sugere uma deleção, é necessário confirmar e caracterizar a alteração com uma técnica quantitativa.

A MLPA é a técnica de escolha nesse cenário. Ela funciona com sondas específicas para cada éxon, que hibridizam ao DNA, são ligadas e amplificadas por PCR. A quantidade de produto amplificado é proporcional ao número de cópias da sequência alvo, permitindo detectar tanto deleções (redução do sinal) quanto duplicações (aumento do sinal) com alta sensibilidade e resolução. Além disso, a MLPA delimita com precisão os pontos de quebra da deleção, informação crucial para a correlação genótipo-fenótipo: deleções que mantêm a fase de leitura (in-frame) geralmente resultam em distrofina truncada, porém funcional, associada à forma mais leve de Becker; deleções que alteram a fase de leitura (out-of-frame) levam à ausência de distrofina funcional, causando o fenótipo grave de Duchenne. Essa distinção é fundamental para o prognóstico e para a elegibilidade a terapias de exon skipping, como a eteplirsen (éxon 51) e a golodirsen/viltolarsen (éxon 53).

A correlação genótipo-fenótipo na DMD é um dos principais objetivos do diagnóstico molecular. Conhecer a extensão exata da deleção permite prever se a proteína será truncada ou ausente, orientando o aconselhamento genético e a escolha de terapias-alvo. Por exemplo, um paciente com deleção dos éxons 45-50 (out-of-frame) tem fenótipo Duchenne clássico, enquanto uma deleção in-frame, como a dos éxons 45-48, pode resultar em fenótipo Becker mais leve. A MLPA, ao fornecer essa informação quantitativa e precisa, é o passo lógico após a triagem por PCR multiplex.

A pegadinha desta questão está em distinguir as técnicas de biologia molecular e suas aplicações específicas. O candidato pode ser tentado a escolher o Southern blot (alternativa D), que também detecta deleções, mas é uma técnica mais antiga, trabalhosa, que requer grande quantidade de DNA de alta qualidade e tem menor resolução para delimitar a extensão da deleção. O Western blot (alternativa C) avalia a expressão da proteína, não a mutação no DNA, e não é necessário para o diagnóstico molecular, que é feito por testes genéticos. O FISH (alternativa B) detecta alterações cromossômicas amplas, não deleções de éxons individuais. O sequenciamento completo do genoma (alternativa A) é um exame mais caro e demorado, não sendo o próximo passo mais adequado quando a PCR multiplex já indicou a região provável da deleção.

Guarde a fronteira entre as técnicas: PCR multiplex é triagem qualitativa; MLPA é confirmação quantitativa e delimitação da extensão; Southern blot é alternativa antiga; Western blot avalia proteína; FISH detecta alterações cromossômicas amplas. É exatamente nessa distinção que as alternativas se dividem.

Alternativa A — ❌ Incorreta

O sequenciamento completo do genoma (WGS) é uma técnica abrangente, mas não é o próximo passo mais adequado neste cenário. A PCR multiplex já indicou a região provável da deleção (éxons 45-50), e o WGS é mais caro, demorado e gera uma quantidade enorme de dados, sendo desnecessário para confirmar uma deleção já localizada. Além disso, o WGS pode não detectar deleções grandes com a mesma precisão da MLPA, que é especificamente desenhada para quantificar o número de cópias de cada éxon. O objetivo aqui é confirmar e delimitar a deleção, não buscar mutações adicionais em outros genes.

Alternativa B — ❌ Incorreta

A hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma técnica citogenética que detecta deleções ou duplicações cromossômicas amplas, visíveis ao microscópio, mas não tem resolução para detectar deleções de poucos éxons, como a dos éxons 45-50 do gene DMD. O gene DMD é enorme (cerca de 2,4 Mb), e uma deleção de 6 éxons pode não ser visível por FISH. Além disso, o FISH é mais adequado para detectar alterações cromossômicas estruturais, como translocações ou grandes deleções que envolvem regiões cromossômicas inteiras, não deleções intra-gênicas.

Alternativa C — ❌ Incorreta

O Western blot avalia a expressão da proteína distrofina nos tecidos, não a mutação no DNA. Embora seja útil para confirmar a ausência ou redução da distrofina, não é o próximo passo para confirmar a deleção dos éxons identificada na PCR multiplex. O diagnóstico molecular da DMD é feito por testes genéticos, e a biópsia muscular com Western blot não é necessária para estabelecer o diagnóstico, conforme o contexto clínico. Além disso, o Western blot não fornece informações sobre a extensão da deleção, que é essencial para a correlação genótipo-fenótipo.

Alternativa D — ❌ Incorreta

O Southern blot é uma técnica que pode detectar deleções, mas é considerada obsoleta para esse fim. Ela requer grande quantidade de DNA de alta qualidade, é trabalhosa, demorada e tem menor resolução para delimitar a extensão exata da deleção. A MLPA a substituiu como padrão-ouro para detecção de deleções e duplicações no gene DMD, pois é mais rápida, sensível e fornece informação quantitativa precisa sobre o número de cópias de cada éxon. Portanto, embora o Southern blot pudesse confirmar a deleção, não é a melhor escolha.

Alternativa E — ✅ Correta ⟵ GABARITO

A MLPA é a técnica de escolha para confirmar e caracterizar a deleção dos éxons 45-50 do gene DMD. Ela é quantitativa, permitindo detectar tanto deleções quanto duplicações, e delimita com precisão os pontos de quebra da deleção. Essa informação é essencial para a correlação genótipo-fenótipo, pois determina se a mutação é in-frame (fenótipo Becker mais leve) ou out-of-frame (fenótipo Duchenne grave), orientando o prognóstico e a elegibilidade a terapias de exon skipping. A MLPA é rápida, sensível e requer pequena quantidade de DNA, sendo o padrão-ouro no diagnóstico molecular da DMD.

Gabarito: letra E