Questão de Biologia — Métodos de Identificação de Bactérias — VUNESP 2024

Coloração de Gram: princípios e aplicação prática

Gabarito: letra B. O método de Gram diferencia bactérias pela estrutura da parede celular: as Gram-positivas retêm o cristal violeta e aparecem azul-escuro/roxas, enquanto as Gram-negativas, como a Escherichia coli, coram-se em vermelho/rosa (contra-coloração com safranina). O Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo, portanto cora em azul-escuro — exatamente o que afirma a alternativa B.

A coloração de Gram é a técnica mais fundamental da bacteriologia clínica. Ela explora uma diferença estrutural profunda entre dois grandes grupos bacterianos: a composição da parede celular. As bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano (20 a 80 nm) que retém o complexo cristal violeta-iodo formado após a aplicação do mordente. Já as Gram-negativas têm uma camada fina de peptideoglicano (1 a 2 nm) envolvida por uma membrana externa rica em lipopolissacarídeos; o álcool-acetona (descorante) dissolve essa membrana externa e extrai o corante primário, deixando a célula incolor até a aplicação da safranina, que a cora de vermelho/rosa.

O procedimento completo segue etapas sequenciais: (1) esfregaço do material sobre a lâmina; (2) fixação — em regra, por calor, passando a lâmina rapidamente sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 passagens), ou por metanol; (3) cristal violeta (corante primário) por cerca de 1 minuto; (4) lugol (mordente) por 1 minuto; (5) álcool-acetona (descorante) por poucos segundos; (6) safranina (contra-corante) por 30 a 60 segundos; (7) lavagem, secagem e observação ao microscópio. A fixação por calor é o método clássico — não se usa estufa a 35–37 ºC para fixar esfregaço, pois isso cozinharia as células e danificaria a morfologia.

A interpretação do resultado depende da morfologia e do arranjo: cocos em cacho (estafilococos), cocos em cadeia (estreptococos), bacilos isolados, diplococos em lanceta (Streptococcus pneumoniae), etc. O S. aureus é um coco Gram-positivo que forma agrupamentos em cacho de uvas — na lâmina, aparece como cachos de esferas roxas/azul-escuras. A E. coli é um bacilo Gram-negativo — aparece como bastonetes róseos. Essa distinção morfo-tintorial é a base do diagnóstico presuntivo imediato em amostras clínicas como escarro, urina e secreções.

A pegadinha central desta questão é a inversão da classificação tintorial: a banca troca o grupo da E. coli (Gram-negativa → rósea) e atribui ao S. aureus a cor errada (seria vermelho, quando na verdade é azul-escuro). O candidato que decora apenas "Gram-positivo = roxo, Gram-negativo = vermelho" sem associar às espécies mais comuns cai na alternativa A. Guarde o par clássico: Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae são Gram-positivos (roxos); Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Haemophilus influenzae são Gram-negativos (róseos).

Alternativa A — ❌ Incorreta

A Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa, portanto cora-se em vermelho/rosa pela safranina, não em azul-escuro. A banca inverteu a classificação tintorial da espécie mais comum de bacilo entérico. Na prática clínica, a E. coli aparece como bastonetes róseos em esfregaços de urina ou secreções.

Alternativa B — ✅ Correta ⟵ GABARITO

O Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo — sua espessa parede de peptideoglicano retém o cristal violeta, corando-se em azul-escuro/roxo ao microscópio. A alternativa está correta ao descrever a morfologia (cocos) e a cor (azul-escuro). É o exemplo clássico de Gram-positivo, frequentemente usado como controle positivo da técnica.

Alternativa C — ❌ Incorreta

A fixação do esfregaço NÃO é feita em estufa a 35–37 ºC. O método clássico é a fixação pelo calor — passar a lâmina rapidamente sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes) — ou por metanol. Estufa a 35–37 ºC é usada para incubação de culturas (crescimento bacteriano), não para fixar esfregaços. A banca trocou o método de fixação pelo de incubação.

Alternativa D — ❌ Incorreta

Não há recomendação de diluir amostras espessas de escarro ou secreções com água deionizada na proporção 1:2 antes do esfregaço. O procedimento correto para amostras espessas é selecionar a porção purulenta/sanguinolenta do escarro com swab ou alça, evitando saliva, e fazer um esfregaço fino e homogêneo — não diluir com água. A diluição com água poderia lisar células e prejudicar a qualidade da coloração. A banca inventou um procedimento inexistente.

Alternativa E — ❌ Incorreta

O controle de qualidade dos corantes e da coloração de Gram não segue um prazo fixo de 90 dias. A prática recomendada é avaliar a qualidade diariamente ou a cada lote de coloração, utilizando cepas controle conhecidas (ex.: S. aureus como Gram-positivo e E. coli como Gram-negativo). O prazo de 90 dias não corresponde a nenhuma recomendação técnica padronizada — a banca criou um número fictício.

Gabarito: letra B — o Staphylococcus aureus cora-se em azul-escuro por ser Gram-positivo.