Questão de Biologia — Bioinformática — VUNESP 2024

CRISPR-Cas9 e eficiência de inserção gênica

Gabarito: letra E. Para aumentar a eficiência da inserção de um gene de interesse via CRISPR-Cas9, a estratégia mais apropriada é aumentar a concentração do doador de DNA homólogo, pois isso favorece o reparo da quebra dupla do DNA (DSB) pela via de recombinação homóloga (HR), que é o mecanismo que permite a inserção precisa do gene desejado. As demais alternativas não atacam diretamente o gargalo da inserção: aumentar exonuclease degradaria o DNA, co-inibir reparo aumentaria mutações, vetor bacteriano não é o foco e diminuir RNA guia reduziria a clivagem.

A técnica CRISPR-Cas9 é uma ferramenta de edição gênica derivada do sistema imunológico bacteriano, que utiliza um RNA guia (gRNA) para direcionar a endonuclease Cas9 a uma sequência específica do DNA, onde ela realiza uma quebra de fita dupla (DSB). Essa quebra pode ser reparada por dois mecanismos principais: a junção de extremidades não homólogas (NHEJ), que é um reparo "descuidado" e frequentemente introduz pequenas inserções ou deleções (indels), e a recombinação homóloga (HR), que utiliza uma molécula de DNA doador homólogo como molde para reparar a quebra de forma precisa. Para a inserção de um gene de interesse, é essencial que o reparo ocorra por HR, pois é essa via que permite a incorporação do gene exógeno no local da quebra. O DNA doador homólogo, portanto, é o substrato que fornece a sequência a ser inserida, e sua disponibilidade é um fator limitante para a eficiência da inserção.

A recombinação homóloga é um processo natural de reparo do DNA que utiliza uma sequência molde para reconstruir a região danificada sem erros. No contexto da edição gênica, o doador homólogo é um fragmento de DNA que contém a sequência do gene de interesse flanqueada por regiões de homologia com o genoma alvo. Quando a Cas9 cliva o DNA, a célula pode usar esse doador como molde para reparar a quebra, incorporando o gene desejado. Quanto maior a concentração do doador, maior a probabilidade de que a célula utilize a via de HR em vez da NHEJ, aumentando assim a eficiência da inserção. Por outro lado, a NHEJ é o mecanismo dominante em células de mamíferos, e sem um doador suficiente, a maioria das quebras é reparada por NHEJ, resultando em indels e não na inserção do gene.

Um exemplo prático: ao tentar inserir o gene GFP em células de camundongo, os pesquisadores fornecem um plasmídeo doador contendo o gene GFP flanqueado por braços de homologia. A eficiência da inserção depende diretamente da disponibilidade desse doador. Se a concentração do doador for baixa, a maioria das células reparará a quebra por NHEJ, resultando em células sem o gene GFP. Aumentar a concentração do doador desloca o equilíbrio para a HR, aumentando a proporção de células que incorporam o gene.

A pegadinha desta questão está em confundir a eficiência da inserção com a especificidade da clivagem. O enunciado menciona mutações fora de alvo e a importância de selecionar locais com alta compatibilidade, mas a pergunta é sobre a eficiência da inserção do gene, não sobre a redução de off-targets. Diminuir a quantidade de RNA guia (alternativa D) reduziria a clivagem, mas também reduziria a eficiência da inserção, pois menos quebras seriam geradas. Aumentar a expressão de exonuclease (alternativa A) degradaria o DNA, prejudicando o processo. Co-inibir uma proteína de reparo (alternativa B) poderia aumentar a frequência de HR, mas também aumentaria a instabilidade genômica e as mutações. Utilizar um vetor bacteriano (alternativa C) não é uma estratégia direta para aumentar a eficiência da inserção em células de mamíferos, pois a transfecção com vetores bacterianos não é o método padrão para CRISPR-Cas9 em células de mamíferos.

Guarde a distinção entre os dois mecanismos de reparo: NHEJ (insere/deleta aleatoriamente) e HR (insere precisamente usando um molde). É exatamente essa fronteira que separa a alternativa correta das demais: a eficiência da inserção depende de favorecer a HR, e isso se faz aumentando o doador homólogo.

Alternativa A — ❌ Incorreta

Aumentar a expressão da enzima exonuclease degradaria o DNA, incluindo o doador e o genoma, prejudicando o processo de reparo e a inserção. Exonucleases removem nucleotídeos das extremidades do DNA, o que poderia destruir o doador homólogo antes que ele fosse utilizado na recombinação. Além disso, não há relação direta entre exonuclease e a via de HR; pelo contrário, a degradação do DNA reduziria a eficiência da inserção.

Alternativa B — ❌ Incorreta

Co-inibir uma proteína de reparo de DNA junto com Cas9 poderia, em teoria, favorecer a HR ao inibir a NHEJ, mas essa estratégia é arriscada e não é a mais apropriada. Inibir proteínas de reparo, como a ligase IV (envolvida na NHEJ), pode aumentar a frequência de HR, mas também aumenta a instabilidade genômica e a toxicidade celular, comprometendo a viabilidade das células. Além disso, a questão busca uma estratégia direta e segura, e o aumento do doador é mais específico e eficaz.

Alternativa C — ❌ Incorreta

Utilizar um vetor bacteriano para a transfecção não é uma estratégia para aumentar a eficiência da inserção do gene. Vetores bacterianos (como plasmídeos) são usados para entregar o DNA doador, mas a eficiência da inserção depende da via de reparo, não do tipo de vetor. Além disso, a transfecção de células de mamíferos com vetores bacterianos pode ser menos eficiente do que outros métodos, como lipofecção ou eletroporação, mas isso não é o foco da questão.

Alternativa D — ❌ Incorreta

Diminuir a quantidade de RNA guia reduziria a clivagem pela Cas9, diminuindo o número de quebras de fita dupla e, consequentemente, a oportunidade de inserção do gene. Embora isso possa reduzir mutações fora de alvo, também reduziria a eficiência da inserção, pois menos quebras seriam geradas para serem reparadas por HR. A questão pede uma estratégia para aumentar a eficiência da inserção, não para reduzir off-targets.

Alternativa E — ✅ Correta ⟵ GABARITO

Aumentar a concentração de doador de DNA homólogo é a estratégia mais apropriada, pois fornece mais substrato para a recombinação homóloga, favorecendo o reparo preciso da quebra e a inserção do gene de interesse. Quanto mais doador disponível, maior a probabilidade de que a célula utilize a via de HR em vez da NHEJ, aumentando a eficiência da inserção. Essa é uma abordagem direta e amplamente utilizada em protocolos de edição gênica.

Gabarito: letra E