Questão de Biologia — Bioinformática — VUNESP 2024

Edição gênica com CRISPR-Cas9

Gabarito: letra D. A técnica CRISPR-Cas9 tem como componente essencial uma proteína Cas9 guiada por RNA (RNA guia, gRNA) para realizar cortes específicos no DNA — é exatamente o que descreve a alternativa D. O sistema CRISPR-Cas9 é derivado do sistema imunológico bacteriano e funciona pelo pareamento de bases entre um RNA não codificante e o DNA genômico, direcionando a endonuclease Cas para gerar uma quebra de fita dupla em um local específico.

A edição gênica em células eucarióticas busca modificar o genoma de forma precisa, e o CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais revolucionárias nesse campo. Para entender por que a alternativa D é a correta, é preciso compreender o mecanismo básico: o sistema é composto por dois elementos fundamentais — a proteína Cas9, que é uma endonuclease capaz de cortar o DNA, e um RNA guia (gRNA), que possui uma sequência complementar ao DNA alvo. O gRNA pareia com a sequência específica do genoma e "guia" a Cas9 até o local exato, onde ela realiza um corte de fita dupla (DSB). Esse corte é então reparado pela célula por dois mecanismos principais: a junção de extremidades não homólogas (NHEJ), que frequentemente introduz mutações (inserções ou deleções) e pode inativar o gene, ou a recombinação homóloga (HR), que pode inserir uma sequência alterada fornecida por um DNA doador. É essa capacidade de direcionar o corte a um local específico que torna o CRISPR-Cas9 tão preciso e versátil.

A origem do sistema é o sistema imunológico adaptativo de bactérias, como Streptococcus pyogenes, que armazena fragmentos de DNA de invasores (fagos ou plasmídeos) em um arranjo CRISPR. Quando o mesmo invasor ataca novamente, a bactéria transcreve esses fragmentos em RNAs guias, que direcionam a Cas para clivar o DNA estranho. Os cientistas adaptaram esse mecanismo para editar genomas de qualquer organismo, incluindo células eucarióticas.

As demais alternativas descrevem elementos que podem estar presentes em protocolos de edição gênica, mas não são componentes essenciais e específicos do CRISPR-Cas9. Por exemplo, um promotor viral pode ser usado para aumentar a expressão do gene de interesse em algumas abordagens, mas não é parte intrínseca do sistema CRISPR-Cas9. Da mesma forma, um vetor de expressão com origem de replicação bacteriana é comum em clonagem molecular, mas não é um componente essencial da técnica de edição em si. A inserção aleatória de elementos genéticos é justamente o oposto da edição precisa que o CRISPR-Cas9 proporciona. E um marcador fluorescente é uma ferramenta auxiliar para monitorar transfecção, não um componente do mecanismo de edição.

A pegadinha desta questão está em confundir elementos acessórios de um experimento de biologia molecular com os componentes essenciais do sistema CRISPR-Cas9. O candidato pode ser tentado a marcar a alternativa A ou B por associá-las a técnicas de expressão gênica, mas a pergunta é específica: qual opção contém corretamente um componente essencial da técnica CRISPR-Cas9? A resposta é a que descreve o mecanismo central: proteína Cas9 guiada por RNA.

Alternativa A — ❌ Incorreta

Um promotor viral é um elemento que pode ser usado para dirigir a expressão de um gene em células eucarióticas, mas não é um componente essencial do sistema CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 não depende de promotores virais para funcionar; ele depende da Cas9 e do RNA guia. Promotores virais (como CMV) são frequentemente usados em vetores de expressão para garantir alta expressão do gene de interesse, mas isso é uma ferramenta auxiliar, não parte do mecanismo de edição.

Alternativa B — ❌ Incorreta

Um vetor de expressão com origem de replicação bacteriana é um elemento comum em clonagem molecular, usado para propagar o DNA em bactérias (como E. coli). No contexto do CRISPR-Cas9, vetores podem ser usados para entregar os componentes (Cas9 e gRNA) às células, mas a origem de replicação bacteriana não é um componente essencial da técnica de edição em si. A essência do CRISPR-Cas9 é a proteína Cas9 e o RNA guia, não o vetor.

Alternativa C — ❌ Incorreta

A inserção aleatória de elementos genéticos no genoma é o oposto do que o CRISPR-Cas9 faz. O CRISPR-Cas9 é uma técnica de edição precisa e direcionada, que gera quebras de fita dupla em locais específicos do genoma, guiadas pelo RNA. A inserção aleatória é característica de outras técnicas, como a transgênese por integração aleatória (por exemplo, usando transposons ou vírus), mas não do CRISPR-Cas9.

Alternativa D — ✅ Correta ⟵ GABARITO

Esta alternativa descreve corretamente o componente essencial do CRISPR-Cas9: uma proteína Cas9 guiada por RNA para realizar cortes específicos no DNA. O RNA guia (gRNA) pareia com a sequência alvo e direciona a Cas9, que é uma endonuclease, para clivar o DNA em um local específico. Esse é o mecanismo central da técnica, conforme descrito na literatura: "no sistema CRISPR-Cas, o pareamento de bases entre um RNA não codificante e DNAs genômicos direcionam a Cas endonuclease para gerar uma DSB em um lugar específico no genoma".

Alternativa E — ❌ Incorreta

Um marcador fluorescente (como GFP) é usado para monitorar a eficiência da transfecção, ou seja, para verificar se as células receberam o vetor ou o DNA exógeno. É uma ferramenta de visualização, não um componente do mecanismo de edição. O CRISPR-Cas9 pode ser entregue junto com um marcador fluorescente para facilitar a seleção de células editadas, mas o marcador não é essencial para a técnica de edição em si.

Gabarito: letra D — a única alternativa que descreve corretamente um componente essencial do CRISPR-Cas9: a proteína Cas9 guiada por RNA para cortes específicos no DNA.