Questão de Biologia — Questões Mescladas de Bioquímica e Biomoléculas — VUNESP 2025

Ensaios moleculares de hibridização: Southern, Northern, dot blot e microarranjos

Gabarito: letra B. As hibridizações Southern e Northern combinam a separação eletroforética do ácido nucleico em teste com a transferência para um suporte sólido e subsequente hibridização, o que permite determinar o peso molecular das amostras — exatamente o que a alternativa descreve. Esse é o princípio fundamental dessas técnicas: a eletroforese separa as moléculas por tamanho e a transferência para a membrana preserva essa separação, permitindo a análise do peso molecular.

Os ensaios de hibridização são ferramentas centrais da biologia molecular, usados para detectar e quantificar sequências específicas de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) ou proteínas. A hibridização baseia-se no pareamento complementar entre uma sonda marcada e a sequência-alvo imobilizada em um suporte. Existem diferentes formatos, cada um com suas particularidades: em fase sólida (dot blot, Southern, Northern, microarranjos) e em fase líquida. A escolha do formato depende do objetivo: detectar a presença de uma sequência, determinar seu tamanho molecular, ou quantificá-la.

A eletroforese em gel é o passo inicial das técnicas Southern e Northern. Ela separa fragmentos de DNA ou RNA com base no tamanho e na carga: moléculas menores migram mais rapidamente pelo gel, enquanto as maiores ficam retidas. Após a separação, as moléculas são transferidas do gel para uma membrana (de nitrocelulose ou nylon) por ação capilar ou eletroforese, mantendo as posições relativas. Em seguida, a membrana é incubada com uma sonda marcada (radioativa ou fluorescente) que hibridiza com a sequência complementar de interesse. A detecção é feita por autorradiografia ou quimioluminescência. Como a posição na membrana corresponde ao tamanho da molécula, é possível estimar o peso molecular comparando com marcadores de peso conhecido.

A distinção entre as técnicas é essencial: no Southern blotting, o material transferido é DNA; no Northern blotting, é RNA; no Western blotting, são proteínas (detectadas por anticorpos). O dot blot, por sua vez, não envolve eletroforese — as amostras são aplicadas diretamente na membrana em pontos discretos, o que simplifica o procedimento, mas impede a determinação do peso molecular. Os microarranjos (microarrays) são uma variação sofisticada: milhares de sondas são imobilizadas em uma lâmina e a hibridização com a amostra marcada permite a análise simultânea de muitos genes, sendo aplicados para cDNA, RNA e oligonucleotídeos.

A pegadinha desta questão está em inverter características entre os formatos: afirmar que o dot blot não é quantitativo (quando pode ser), que a fase líquida não permite quantificação (quando permite), ou que a fase sólida tem cinética mais rápida que a líquida (quando o oposto é verdadeiro). A alternativa B é a única que descreve corretamente o princípio das técnicas Southern e Northern, sem introduzir erros conceituais.

Guarde a fronteira entre os formatos: a presença ou ausência de eletroforese é o critério que separa o dot blot (sem eletroforese) das técnicas Southern/Northern (com eletroforese), e é exatamente nesse ponto que as alternativas se dividem.

Alternativa A — ❌ Incorreta

O erro está na afirmação de que o dot blot "não pode ser quantitativo". O dot blot pode sim ser utilizado para quantificação, embora de forma menos precisa que outras técnicas. A limitação correta do dot blot é a impossibilidade de determinar o peso molecular das amostras, pois não há separação eletroforética — as amostras são aplicadas diretamente na membrana. A banca troca a limitação real (sem eletroforese, sem informação de tamanho) por uma falsa (não quantitativo).

Alternativa B — ✅ Correta ⟵ GABARITO

A alternativa descreve com precisão o princípio das técnicas Southern e Northern: separação eletroforética do ácido nucleico, transferência para suporte sólido e hibridização com sonda. A eletroforese separa as moléculas por tamanho, e a transferência para a membrana preserva essa separação, permitindo determinar o peso molecular das amostras por comparação com marcadores. É exatamente isso que diferencia essas técnicas do dot blot.

Alternativa C — ❌ Incorreta

A afirmação de que a hibridização em fase líquida "não permite quantificar o produto" está errada. A hibridização em fase líquida permite sim a quantificação, pois a cinética da reação é mais rápida e a extensão da reação é maior, o que facilita a medição do produto formado. A banca inverte a característica: a fase líquida é justamente o formato que permite quantificação eficiente.

Alternativa D — ❌ Incorreta

O erro está em afirmar que os ensaios em fase sólida têm "cinética mais rápida e maior extensão de reação" que os meios líquidos. Na realidade, é o oposto: a hibridização em fase líquida apresenta cinética mais rápida e maior extensão de reação, pois as moléculas estão livres em solução, facilitando o encontro entre sonda e alvo. Na fase sólida, a sonda ou o alvo está imobilizado, o que torna a cinética mais lenta.

Alternativa E — ❌ Incorreta

A alternativa erra ao afirmar que os microarranjos são aplicados "apenas para detecção e quantificação de oligonucleotídeos, mas não para cDNA ou RNA". Os microarranjos são amplamente utilizados para análise de expressão gênica, o que envolve a hibridização de cDNA ou RNA marcado com sondas imobilizadas na lâmina. A limitação apresentada é falsa: os microarranjos são aplicados justamente para cDNA e RNA, permitindo a análise simultânea de milhares de genes.

Gabarito: letra B